重大突破！近红外荧光纳米传感器，助力催产素作用机制研究

研究背景

PART 1

催产素主要在下丘脑合成，广泛分布于中枢和外周神经系统。它不仅参与生殖行为，还和社会互动、情感调节紧密相关。然而，一旦催产素信号传导出现异常，就可能引发一系列神经疾病，比如精神分裂症、焦虑症和自闭症等。因此，搞清楚催产素的作用机制，对治疗这些疾病有着重要意义。不过，现有的研究工具却存在不少问题。因此，开发一种能实时、精准成像催产素的新技术，就成了科研人员亟待解决的问题。

研究方法

PART2

为了攻克这些难题，科研人员另辟蹊径，采用了一种基于碳纳米管吸附的单链 DNA 配体指数富集系统进化技术（SELEC）的创新方法。这种方法的核心，是利用单链 DNA（ssDNA）在近红外荧光单壁碳纳米管（SWCNT）表面，进行纯合成分子识别的演化。SWCNT不仅生物相容性好、光稳定性强，而且具有组织透明荧光的特性。

图 1. 催产素分子式

科研人员设计了一个包含超多随机 18 聚体单链 DNA 序列的文库，让这些序列和 SWCNT、催产素充分混合。经过多轮筛选、扩增，再通过深度测序，蕞终找到了对催产素敏感度超高的单链 DNA 序列，成功制备出了 nIROT-SELEC 纳米传感器。

实验过程

PART 3

3.1 SELEC 实验流程

从含 18 个随机核苷酸、两侧有特定序列的单链 DNA 文库出发，将其与 pH5 的醋酸盐缓冲液、SWCNT 混合，经浴超声、加热变性、冷却后加催产素，再经探针尖端超声、离心、过滤等操作分离结合的单链 DNA，接着 PCR 扩增，确定合适循环数后进行制备性 PCR，产物纯化、提取、脱盐、浓缩，后续轮次将干燥单链 DNA 重悬继续筛选。

图 2. SELEC 纳米传感器发现过程示意图。

3.2 高通量测序与分析

对 SELEC 文库进行两轮 PCR 添加测序适配序列和索引，用 Illumina HiSeq 4000 测序，筛选正确固定区域序列，借助 FASTAptamer 工具处理数据，利用 matplotlib 和 MATLAB 对前 200 个序列可视化。

3.3 合成 ssDNA-SWCNT 纳米传感器

在特定试管中混合 HiPCo SWCNT 浆液和单链 DNA，经涡旋、浴超声、探针尖端超声、两次离心后，测吸光度计算浓度，稀释后 4°C 平衡至少 24 小时。

3.4 光学表征纳米传感器

用定制光谱仪和探测器采集近红外荧光光谱，激发波长 721nm，测量不同时间点荧光，计算 ΔF/F₀；对表面固定纳米传感器，在荧光显微镜下用 721nm 激光激发成像，处理图像并分析 ROI。

3.5 急性切片制备与纳米传感器标记

选用 14 - 17 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，按规范流程制备急性脑切片，用含纳米传感器的溶液孵育切片，冲洗后成像。

3.6 近红外显微镜设计与实验

搭建显微镜，以 785nm 激光激发，经滤光片和物镜作用，用探测器采集荧光，由 Micro - Manager 软件控制。实验时，先记录基线，刺激后再记录，添加喹吡罗后重复操作。

3.7 图像处理与数据分析

用定制 MATLAB 应用或 Python 代码处理成像文件，计算相关参数，如 ΔF/F₀、确定 ROI 数量等，分析数据。

研究结果

PART4

该研究成功开发了基于单链 DNA（ssDNA）修饰的近红外荧光单壁碳纳米管（SWCNT）的催产素纳米传感器 nIROT-SELEC，用于高时空分辨率成像，为研究催产素神经传递提供了有力工具，具体研究结果如下：

4.1 筛选出ssDNA-SWCNT构建体

通过SELEC技术对超过10¹⁰个随机18聚体ssDNA序列进行筛选进化，经过6轮筛选后，实验文库和对照文库出现明显差异，表明成功进化出识别催产素的序列。分析发现实验文库中腺嘌呤富集，且特定三聚体（GGG、AGG和GGC）在进化中起重要作用。从实验文库中筛选出的序列制备的纳米传感器对催产素响应更强，其中E6#4-SWCNT表现最佳，被选定为 nIROT-SELEC 纳米传感器。

图 3. SELEC 技术进化出用于催产素分子识别的单链 DNA - 单壁碳纳米管（ssDNA-SWCNT）纳米传感器。

4.2 nIROT-SELEC纳米传感器性能优越

灵敏度高：在体外实验中，nIROT-SELEC对催产素响应呈浓度依赖性，具有纳摩尔级灵敏度，平衡解离常数（K_d）为4.93 ± 3.19 μM。
选择性好：该传感器对大多数神经化学物质具有选择性，虽对多巴胺也有响应，但使用喹吡罗抑制多巴胺释放后，可实现对催产素的特异性成像。在成像实验中，固定在玻璃片上的nIROT-SELEC对催产素的结合动力学比加压素更快，且在持续激光照射下荧光稳定，无明显光漂白现象（小鼠的脑切片成像采用了Raptor Photonics Ninox 640 SU 短波红外相机）。

图 4. nIROT-SELEC 展示出对催产素的敏感性和选择性。(A) 添加 100μM 催产素前后，nIROT-SELEC 的荧光强度光谱，黑色虚线表示添加前，红色表示添加后。(B) 在磷酸盐缓冲液（PBS）中，nIROT-SELEC 对浓度从 50nM 到 100μM 的催产素的荧光调制情况。(C) nIROT-SELEC 对 50μM 的催产素（OT，n = 15）、加压素（VP，n = 6）、多巴胺（DA，n = 3）、γ- 氨基丁酸（GABA，n = 3）、谷氨酸（Glu，n = 3）、促甲状腺激素（TRH，n = 3）、阿托西班（Ato，n = 3）、L-368,899（n = 3）以及卡贝缩宫素（Carb，n = 3）的响应。误差线表示标准差。(D) 固定化的 nIROT-SELEC 对 100μM 催产素（红线）和 100μM 加压素（黑线）的时间积分 ΔF/F₀。阴影区域表示标准差。(E) 固定化 nIROT-SELEC 在同一视野下的近红外荧光图像，左图为添加 PBS 后 30 秒的图像，中图为添加催产素后 30 秒的图像，右图为蕞后时间点的图像。(F) 固定化 nIROT-SELEC 在同一视野下的近红外荧光图像，左图为添加 PBS 后 30 秒的图像，中图为添加加压素后 30 秒的图像，右图为最后时间点的图像。比例尺代表 10μm。

4.3 实现脑组织中催产素的成像

在急性小鼠脑切片实验中（小鼠的脑切片成像采用了Raptor Photonics Ninox 640 SU 短波红外相机），nIROT-SELEC能实时监测电刺激诱发的催产素释放。在室旁核（PVN）和伏隔核（NAc）区域，电刺激均导致nIROT-SELEC荧光强度增加。使用喹吡罗抑制多巴胺释放后，不同脑区的纳米传感器荧光强度和释放位点数量发生变化，进一步证明了nIROT-SELEC在复杂脑环境中的可靠性，并提供了不同脑区多巴胺和催产素分布的相关信息。

图 5. nIROT-SELEC 在体外检测神经调节剂。(A) 在标准人工脑脊液（aCSF）中，对室旁核（PVN）施加 0.5 mA 电刺激后，同一视野的近红外荧光图像。每组展示三帧图像：（左图）“刺激前” 是电刺激前 nIROT-SELEC 的基线荧光；（中图）“刺激中” 是电刺激后立即采集的荧光图像；（右图）“刺激后” 是 nIROT-SELEC 荧光恢复到基线后的图像。比例尺代表 10μm。(B) 在标准 aCSF 中，对伏隔核（NAc）施加 0.5 mA 电刺激后，同一视野的近红外荧光图像。每组展示三帧图像：（左图）“刺激前” 是电刺激前 nIROT-SELEC 的基线荧光；（中图）“刺激中” 是电刺激后立即采集的荧光图像；（右图）“刺激后” 是 nIROT-SELEC 荧光恢复到基线后的图像。比例尺代表 10μm。(C) nIROT-SELEC 在体外对催产素、喹吡罗以及喹吡罗 + 催产素的响应。(D) 在室旁核中，添加（红色）和不添加（黑色）2μM 喹吡罗后的时间进程积分 ΔF/F₀。实线（阴影部分）是三次刺激重复实验的平均值（标准差）。(E) 在伏隔核中，添加（红色）和不添加（黑色）2μM 喹吡罗后的时间进程积分 ΔF/F₀。

研究意义

PART5

这项研究成果意义非凡。从技术层面看，它首次证明了 SELEC 技术可以为像催产素这样结构复杂的神经肽，进化出高灵敏度的分子识别元件，为今后开发更多用于生物成像的纳米传感器，提供了全新的思路和方法。

从神经科学研究角度来说，nIROT-SELEC 纳米传感器就像一把 “金钥匙”，为我们打开了深入研究催产素神经传递的大门。它能够在高时空分辨率下，实时观察催产素在大脑中的动态变化，这对于我们理解催产素在健康和疾病状态下的作用机制，有着不可估量的价值。比如说，它可以帮助我们深入探究多巴胺和催产素之间的相互作用，为治疗相关神经疾病提供更精准的理论依据。

原文链接：https://doi.org/10.1101/2024.05.10.593556